吳摘 王新剛 趙振民

　　［摘要］目的 探討建立幼年 SD 大鼠顱骨器官體外培養(yǎng)矢狀縫牽引成骨模型。方法 取 19 的 SD 大鼠顱頂骨矢狀縫組織塊， 10‐³N (0.4g)力，對照組不加力。培養(yǎng) 24 h 結束時，進行大體觀察及倒置顯微鏡下觀察；并劷蘇木精-伊紅染色后進行組織學觀察。結果 大體觀察及倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組骨縫逐漸明顯加寬，加排列24 h ，所有標本矢狀縫未見斷裂。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，縫兩側區(qū)域為成骨活躍部位，兩側骨化前沿交錯縫內可見纖維結締組織、成骨細胞、成纖維細胞及毛細血管，縫內組織與硬腦膜相連縫保持正常發(fā)育，未見明顯變化，以成骨細胞為主。結論 大鼠顱骨骨縫器官可以在體外培養(yǎng)中成功存活并繼續(xù)生長。

　　【 關鍵詞 】 顱縫；器官培養(yǎng)技術；機械張力

　　Rat cranial sutures in vitro:a new experimental model for studying the osteogenic to tensile force WU Di,WANG Xin-gang,YIN Ning-bei, ZHAO Zhen-min．Department  of Cleft Lip and Palate,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China

　　[ Abstract ] objective To develop an in vitro model for cranial suture of neonatal SD rat .Methods  The parietal bones with the sagittal suture were removed from SD rats ( 19-days old ) for organ culture, In the experimental group , tensile force 3 . 92 х10‐³N(0.4g) was applied by helical springs ,whereas no applied tension ( ON ) was set in control group . explants were observed under inverted microscope . At the end of the incubation period for 24 hours , general conditions observed under inverted microscope and histological conditions were observed after hematoxylin and were observed after hematoxylin and eosin stain . Results  Under inverted micrope, sutures had no obviolls changes In control group , whereas sutures were enlarged gradually in the experimental group . With histological observation , sutures developed normally in control group , but in experimental group ,osteohlasts and capillary vessels proliferated actively in the suture . Conclusions In vitro model of cranfa cranial suture can be cultured and grown successfvel.

　　［Key words］ Cranial suture; Organ culture techniques；Stress , Mechanical

　　骨縫是顱面骨骼生長的主要部位，被硬腦膜等組織包繞，位于堅硬的骨骼之間。體外實驗是將離體骨縫組織置于培養(yǎng)基中進行牽引，這不僅避免了體內綜合因素的影響，還可單獨對縫組織施加某種條件，以明確它的作用。我們通過顱骨骨縫器官培養(yǎng)和體外縫牽引技術，建立幼年大鼠顱骨矢狀縫牽引成骨模型，從而能簡便客觀地研究顱縫牽引生物學變化規(guī)律。

　　材料與方法

　　一、材料

　　1．牽引裝置制備：按照 Hickory 和 Nanda 的方法設計螺旋彈簧(HiIckory WB , Nanda R . Effect of tensile force magnitude on release of cranial suture cells into 5 phase . Am J Orthod Dentofac Orthop , 1987 , 91 ( 4 ) : 328-334 .)。應用直徑為25 mm 的正畸矯治鋼絲彎制成螺旋彈簧，彈簧體部伸出兩臂，臂分為水平部分和末端向下彎曲 900 的垂直部分。彈簧直徑是 4mm ，圈數(shù)為 6 圈。臂水平部分長為 50 mm ，垂直部分為 7 mm 。當兩臂末端壓縮距離為 7mm 時即為 3 . 92х10‐³N ( 0 . 49 ）的張力，當垂直置人部分用膠布固定時即為 O N 張力。

　　2 ．動物標本的切取：選用 19 日齡的 sD 大鼠 20 只，由北京維康利華公司提供。術區(qū)消毒后，在解剖顯微鏡下暴顯顱蓋骨，包括兩側的頂骨及其間的矢狀縫，其寬為 8 mm ，長為 10 mm ，保留顱骨外膜和硬腦膜。隨機分為對照組（不加力）和實驗組加 3 . 92 X 10‐³N ( 0 . 49 ）力進行體外培養(yǎng)（圖 1 ）。

　　二、方法

　　1 ．器官培養(yǎng)：將顱蓋骨標本放人裝有無酚紅高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（ DMEM ）的培養(yǎng)皿中，在 37 °C 、 5 ％的 CO2 ：孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入10%的牛頜血，青霉素，鏈霉素。于24 h 收集組織標本。

　　2 ．組織學處理：將培養(yǎng) 24h 的標本置于 10 % 中性甲醛溶液中固定 10h 后，用乙二胺四乙酸 ( EDTA ）脫鈣液（由中杉金橋試劑公司提供）脫鈣 10d ，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作 4μm 厚的切片。
 
3 ．蘇木精一伊紅（ HE ）染色：蘇木精染液浸泡 3～4min ，流動自來水沖洗； 1 ％鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流動自來水沖洗； 1 ％氨水顯藍 30s 1 min ，流動自來水沖洗后鏡檢；伊紅染色 40s，流動自來水沖洗 30s ；置于 75 ％乙醇中 20s ; 95 ％乙醇中 l～Zmin ，共 2 次；無水乙醇中 1～Zmin ，共 2 次；置于二甲苯工中 2min ，二甲苯 11 中 2min ；中性樹膠封片。

　　結果

　　一、大體觀察

　　大鼠顱骨標本劷體外培養(yǎng) 24h 后，標本未見壞死。對照組骨縫未見明顯變化。實驗組應用彈簧進行縫牽引后，骨縫逐漸加寬，加力 24h 有標本矢狀縫未見斷裂。

　　二、倒置顯微鏡下觀察于低倍倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)液未見細菌污染，顱骨標本未見壞死。對照組骨縫未見明顯變化。實驗組應用彈簧牽引后，骨縫逐漸加寬，加力 24h ，所有標本矢狀縫未見斷裂，與大體觀察相吻合（圖 2 ）。 

　　三、組織學表現(xiàn)實驗組標本骨縫明顯增寬，縫兩側區(qū)域為成骨活躍部位，兩側骨化前沿交錯排列?？p內可見纖維結締組織、成骨細胞、成纖維細胞及毛細血管，縫內組織與硬腦膜相連；兩側骨化前沿可見有成骨樣細胞，說明不斷有新骨形成。對照組標本骨縫保持正常發(fā)育，以成骨細胞為主。對照組和實驗組均未見組織壞死（圖 3 ）。

　　討論

　　在正常生理狀態(tài)下，顱面骨縫處于幾種力的綜合作用下，大致分為壓力、拉力及切應力。張力的產生主要來自于生長中的腦組織，它對顱頂產生向外的作用力。對于顱頂內表面及其骨縫而言是一種壓力，促進骨吸收；而對于外表面及其骨縫又是一種拉力，促進骨形成。這兩種力綜合作用的結果便使顱骨容積增大(Sun Z , Lee E , Herring SW . Cranial SutureS and bones : growth and fusion in relation to masticatory strain . Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol , 2004 , 276 ( 2 ) : 150- 161 .)。可以這樣認為，骨縫使顱骨縱向生長，如果沒有骨縫，顱骨將只能增厚。張力還可產生于咀嚼肌，它通過鄰近的骨傳遞給縫，既可表現(xiàn)為拉力，也可表現(xiàn)為壓力。除此以外，有報道認為顱面骨縫還受到切應力的作用［ Rafferty KL , Herring SW , Marshall CD . BiomechanicS of the rostrum and the role of facial Sutures . J Morphol , 2003 , 257 ( 1 ) : 33-44 . ］。由于其檢測技術復雜，切應力一般并不單獨用于骨縫的研究。但我們應該考慮到，在對骨縫施加拉力或壓力時，切應力可能會隨之產生，這將影響實驗結果的準確性。

　　幾乎所有的顱面骨縫都曾被用于張力研究［ Alaqeel SM , Hinton RJ , opperman IA . Cellular response to force application at craniofacial sutures . Orthod Craniofacial Res , 2006 , 9 ( 3 ) : 111-122 . ］。本實驗選擇顱骨矢狀縫為研究對象。對于體內實驗，矢狀縫和冠狀縫較為常用，因為上頜骨在矯正顱面部畸形中的重要作用，對其周圍骨縫的研究也很多。選擇骨縫一個很重要的原則應是易于獲取，覆蓋顱骨矢狀縫的軟組織血供少，又無肌肉附著，遠離口鼻區(qū)域，切取標本及培養(yǎng)時不易被污染機械張力對顱面骨縫作用的實驗研究主要分為體內及體外兩種。體內實驗是對不同動物的骨縫施加直接或間接張力，觀察受力后縫的變化情況。其中間接張力可以來自縫周圍的牙齒或肌肉，通過改變牙齒或肌肉的力量間接影響骨縫的受力程度［Byron CD , BorkeJ , Yu J , et al . Effects of increased muscle mass on muouse sagittal suture morphology and mechanics . Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Blol , 2004 , 279 ( 1 ) : 676-684 .Hamrick MW , Samaddar T , PenningtonC , et al . Increased muscle mass with myostatin deficiency improves gains in bone strength withe 父 ercise . J Bone Miner Res , 2006 , 21 ( 3 ) : 477- 483〕 。先前的體內實驗，加力系統(tǒng)力值通常在作用于被研究的顱面骨縫之前測量，由于顱面結構的復雜性，在加力系統(tǒng)作用于顱面骨縫時，有部分力作用于顱面骨縫之外的其他結構。

　　因此，很難通過體內實驗研究力的變化和組織學反應之間的相關性，體內實驗研究不能真實反映骨縫受外力作用后的骨改建情況。體外實驗是將離體骨縫組織置于培養(yǎng)基中進行牽引，這避免了骨縫周圍組織和全身因素的影響。本實驗采用體外研究方法。自制螺旋彈簧，以顱縫為中心，兩側正中打孔安置彈簧，孔距 7 mm 。當彈簧壓縮為 7 mm 時產生 3 . 92xl0³ N ( 0 . 4g）張力，這樣控制彈簧力的大小和方向，避免旋轉。

　　對骨縫施加張力后，內部細胞數(shù)量和活性都會隨之改變。成骨細胞和破骨細胞的比例將決定較終發(fā)生合成還是分解反應。當骨縫受拉力作用，成骨細胞、骨細胞和毛細血管均增加；成纖維細胞對力大小的變化也很敏感，隨著力值的增加，成纖維細胞的數(shù)量也會增加；力的作用時間及大小對骨祖細胞都會產生作用，較大的張力在初期會使細胞數(shù)量增加，隨后會迅速減少。而以較小的張力持續(xù)作用于骨縫也會使骨祖細胞增加。骨縫受到壓力作用會產生相反的效果，破骨細胞增加，破骨活性強于成骨活性，引起分解反應。在機械張力的作用下，主要由骨縫中的成骨細胞和成纖維細胞分泌多種細胞因子，包括月轉化生長因子（ TGF 一因、胰島素生長因子 (TGF-β ）、成骨蛋白（ BMP ）、堿性成纖維細胞生長因子 ( bFGF ）等(Maxson R , lshii M . The Bmp pathway in Skull vault development . Front Oral Biol , 2008 , 12 : 197-208 . H irukawaK , MiyazawaK , MaedaH , et al , Effect of tensile force on the expression of IGPI and IGF-1 receptor in the organcultured rat cranial suture . Arch Oral Biol , 2005 , 50 (3)：367-372 . Song HM , Fong KD , Nacamuli RP , et al . Mechanisms of murine cranial suture patency mediated by a dominant negative transforming growth factorbeta receptor adenovirus . Plast Reconstr Surg , 2004 , 113 ( 6 ) : 1685-1697 .)，它們通過自分泌和旁分泌調節(jié)成骨細胞的活性。
組織學分析是反映骨縫生長發(fā)育的一個實用指標。本實驗模型的組織學觀察是：對照組標本骨縫保持正常發(fā)育，以成骨細胞為主。實驗組標本骨縫明顯增寬，縫內成骨細胞活躍，毛細血管增生。未見組織壞死和細菌感染。提示骨縫器官能在體外培養(yǎng)中存活并能繼續(xù)生長發(fā)育，證明本模型建立成功.骨縫器官培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)相比更接近于機體內的生長情況，體外器官培養(yǎng)在機械張力對顱面骨縫成骨作用的研究中有實用價值。

　　綜上所述，骨縫是一種獨特的組織，它可以向成骨細胞及成纖維細胞分化，成骨細胞分泌骨基質，而成纖維細胞對其有抑制作用，從而維持縫的穩(wěn)定。當施加機械刺激時，在多種細胞因子的參與下，兩種細胞重新達到平衡，或者促進骨形成，或者引起骨吸收。今后我們將在細胞水平、分子水平及基因水平研究骨縫的機械傳導通路，以便能以較適合的機械刺激指導臨床治療。